研究清楚跨不同人群的健康肠道微生物组的分类和功能组成对于了解其在维持人类健康中的作用至关重要。多项大规模、全球范围的微生物组项目揭示了健康个体由于分娩方式、年龄、地理位置、饮食和生活方式等因素会引起肠道微生物组成的变化。饮食、肠道微生物和人类健康之间复杂的相互作用，以及关键微生物代谢产物如短链脂肪酸 (SCFAs) 和支链氨基酸 (BCAAs) 的作用，正愈来愈引起研究者的广泛关注。下面的研究，使用多组学方法——16S rRNA基因测序+宏基因组测序+代谢组检测对来自印度两个不同地区（中北部和南部）的110 名健康人的肠道微生物组和代谢组进行了系统研究。其中的研究思路，值得想要开展不同地区不同民族人群的肠道菌群组成与功能差异研究的老师参考。
发表期刊：GIGA SCIENCE
发表时间：2019
影响因子：4.688
研究内容：肠道菌群与人群、饮食、环境等关系
实验方法：16S rRNA基因测序+宏基因组测序+非靶向代谢组学
样本数量与类型：110份粪便样本（16S+宏基因组+非靶向代谢组），血清样本（非靶向代谢组）
110个样本来自于53个LOC1（印度中北部，主要饮食为包括富含碳水化合物的食物，“素食者”）与57个LOC2（印度南部，主要饮食为大米、肉、蛋等类，“杂食者”），已知LOC1印度人更易患糖尿病，心血管疾病和高血压。样本选取规则为：从婴儿（小于1岁）到老年（大于50岁），平均年龄为29.72±17.4岁的健康人群，男女比例为1:1。每个粪便样品在采集后30分钟内冷冻，在收集粪便样本之前的一个月内，记录受试者关于性别、年龄和饮食的信息，被招募的个体的平均BMI为21.16(±5.23)。对110个粪便样本分别进行16S测序、宏基因组测序、代谢组学分析，对部分受试者的血清样本进行代谢组学分析，并结合其他地区群体的16S、宏基因组数据进行后续分析（表1）。1. 构建印度人肠道微生物基因目录以及更新整合基因目录基于de Bruijn图形的组装结果筛选≥500bp的contig，并对未组装的序列进行混合组装，以获得低覆盖率的基因组的序列，同样筛选≥500bp的contig，最终通过基因预测获得1551581个非冗余基因，代表了印度人队列的肠道微生物基因目录。进一步与Li等人建立的多队列整合基因目录(Integrated gene Catalogue，IGC)进行整合(与IGC的同源性<90%)，得到更新印度人队列的整合基因目录以作为后续参考基因目录，显著提高了印度人队列序列比对率（图1）。图1 比对到IGC和更新的IGC（包含印度人基因目录）的Reads百分比
根据属水平物种注释结果将来自多个群体的样本分类为cluster，并识别出三个称为肠型的突出cluster：LOC1的样本(73.5%)与肠型2（普氏菌为主）有关，LOC2样本与肠型1(30.3%,拟杆菌为主)和肠型-3型(16.07%,瘤胃球菌为主)相关。对于宏基因组样本数据，基于样本之间的pearson相关性>=0.9的基因聚类成924个cluster,其中包含335个MGS（基因>=700的cluster）,5 89个CAGs（基因>=100的cluster）,通过分类学方法识别到195个cluster的种水平信息(图C);使用负二项(NB)模型为基础的Wald检验识别富集到的MGS表明，拟杆菌、瘤胃球菌在印度人队列中的低丰度水平；使用随机森林特征分类方法同样也表明了在印度人队列中的高丰度普氏菌作为标记分类群的重要性。在16S结果中高丰度的普氏菌也得到了很好的体现，同时利用16S数据可以获得物种之间进化关系，获得系统发育树。通过将宏基因组数据比对到eggNOG及KEGG数据库，结果显示了印度人肠道微生物的核心功能与辅助功能，LOC1主要富集到碳水化合物和能量代谢的功能，包括复杂多糖和糖原的降解，也富含来自TCA循环的酶，β- glucosidase、α-fucosidase等分解植物多糖的酶，这与北印度人富含碳水化合物的饮食相符合；LOC2主要富集到lipase、carnitine-coA dehydratase、amino peptidase等参与动物性饮食的新陈代谢酶（图2）。图2 火山图显示，印度人群与其他人群相比（C）Eggnog和（D）Kegg功能的富集或损耗为了确定样本间微生物图谱的差异性最大的协变量，根据16S数据计算OTU之间unifrac距离，将年龄、饮食、地点(LOC1和LOC2)和性别等协变量的影响与使用unifrac距离的主成分分析确定的主成分进行相关性比较等解释了不同位置与饮食是主要的协变量。为了深入了解不同饮食对微生物新陈代谢活动的影响，通过代谢组学分析确定其联系。基于PAM (partitioning around medoids) 聚类方法通过Between-class分类分析将代谢物划分为3个cluster，其中cluster1与LOC1相关，显示出较高浓度的饱和脂肪酸，包括棕榈酸、硬脂酸和戊酸；cluster3与LOC2相关，并显示出较高丰度的BCAA、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸以及SCFA、丙酸和丁酸（图3）。PERMANOVA分析(表2)与OPLS-DA分析(图4)都显示样品差异的主要变量为位置，第二重要变量为饮食。图3 样品的代谢产物簇 (MES) 丰度谱并聚为3个cluster
图4 基于代谢组谱，OPLS-DA分析显示位置可以区分样品通过鉴定标记代谢物发现，普氏菌注释的cluster与戊酸和景天庚酮糖显著相关，它们在LOC1中显示出较高的相对丰度（图5A）；LOC2中粪便BCAA丰度与BCAA转运蛋白丰度呈正相关,而粪便BCAA丰度与BCAA生物合成途径呈负相关（BCAA，支链氨基酸，是通过刺激胰岛素分泌而参与葡萄糖稳态的重要代谢物），而LOC1个体的血清BCAA浓度明显高于LOC2个体（图5B）。可能原因是LOC2中个体BCAA粪便中的积累是由肠道细菌向内运输BCAA介导的，LOC1中肠道微生物中较低的BCAA积累和较高的BCAA生物合成及其在血清中的最终吸收（图6）。图5 微生物物种代谢物与代谢模块的Spearman等级相关性
图6 BCAA转运蛋白在维持粪便和血清中BCAA水平方面发挥关键作用通过WGCNA分析对代谢功能进行模块分类，使用Spearman相关系数将每个模块内的KO与来自其他模块的KO相关联，确定了在LOC1和LOC2之间相关性存在显着差异的KO，BCAA生物合成模块在LOC1和LOC2中显著差异，而BCAA模块在LOC1和LOC2独立驱动。通过将代谢组谱中于微生物进行关联分析，鉴定到代谢组谱中对BCAA丰度贡献最大的物种（图7）。图7 在LOC1和LOC2人群中，支链氨基酸生物合成、降解和转运 KEGG模块之间的Spearman相关性网络分析
本文结合多组学分析方法，揭示了印度人肠道微生物组的独特组成，建立了印度人肠道微生物基因目录，并将其与其他人群的肠道微生物组进行比较。使用宏基因组学和代谢组学方法揭示的功能关联为肠道-微生物-代谢轴提供了新颖的见解，这将对未来的流行病学和转化研究具有指导意义。